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近日，中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心團隊等，開發(fā)了檢測RNA結(jié)合蛋白（RBP）在RNA上結(jié)合位點的高靈敏、高信噪比深度測序方法uSpyCLIP，并運用這一技術(shù)揭示了兩種目前應用最為廣泛的Cas13核酸酶——Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13b和Ruminococcus flavefaciens XPD3002 (Rfx)Cas13d的gRNA依賴性以及gRNA非依賴性脫靶結(jié)合位點的特征，為未來RNA編輯、檢測和治療應用中Cas13和gRNA的優(yōu)化設計提供了指導。該技術(shù)通過最小化RBP融合標簽設計，降低了對RBP活性的干擾，在識別RBP結(jié)合位點時具有高靈敏性和特異性，可以在相同測序深度下檢測到更多的結(jié)合位點，并支持僅使用1000個細胞完成RBP結(jié)合位點圖譜測定。此外，uSpyCLIP技術(shù)依托磁珠進行操作，便于實現(xiàn)自動化、減少人工投入，且整個流程僅需兩天。研究人員運用uSpyCLIP技術(shù)，繪制出dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA復合物在轉(zhuǎn)錄組中的結(jié)合位點分布圖譜。結(jié)果顯示，dCas13的結(jié)合行為比先前預想的更為廣泛。研究同時對兩種dCas13-gRNA復合物的脫靶結(jié)合行為進行表征和驗證，證實dCas13蛋白的gRNA非依賴性脫靶位點，具有獨特的RNA識別位點結(jié)構(gòu)和序列特征。對gRNA依賴性脫靶位點的分析顯示，gRNA的DR遠端區(qū)和中部區(qū)域在決定結(jié)合特異性中具有關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，以上部分脫靶事件導致非靶標基因的mRNA和/或蛋白質(zhì)水平基因表達發(fā)生變化。這表明，基于dCas13或dCas13—效應子融合蛋白的應用，如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、RNA成像和RNA編輯，可能因脫靶結(jié)合而產(chǎn)生復雜的毒副作用。這一研究為檢測Cas13的脫靶結(jié)合位點提供了新的技術(shù)手段與研究策略，并深化了關(guān)于Cas13系統(tǒng)的認知，為特異性gRNA的合理設計以及Cas蛋白的工程改良提供了理論支撐。相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上。研究工作得到得到國家自然科學基金委員會、科學技術(shù)部、中國科學院的支持。論文鏈接dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA復合物脫靶結(jié)合位點的特征